NanoView公司所開發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)是一款無需純化的、全自動的可對單個(gè)外泌體進(jìn)行表征分析的全新設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全面的外泌體表征信息，包括外泌體粒徑大小、計(jì)數(shù)、分布、攜帶蛋白表達(dá)、生物標(biāo)志物（CD9，CD81，CD63等）共定位等。操作簡單，結(jié)果可靠。一經(jīng)推出，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，短短兩年時(shí)間在全球已有50多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用該技術(shù)，發(fā)表重要文獻(xiàn)近百篇。

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)基本原理是一種基于特異性免疫捕獲技術(shù)，允許研究者直接分析特定群體的外泌體或外囊泡。通過配套的試劑盒，客戶一次性能夠分析多達(dá)9個(gè)不同的樣本，大大節(jié)省了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。兼容各種生物樣本，除了純化的外泌體之外，對于血液、尿液、惡性腫瘤、腹水中的外泌體也可直接檢測分析，大大拓展了研究范圍

應(yīng)用方向及主要特征

生物標(biāo)記物共定位 最多可量化4種標(biāo)記物的表達(dá)情況	計(jì)數(shù)分析 直接從樣品中計(jì)算抗原陽性外泌體的數(shù)量，無需提純
粒徑分析 高精度統(tǒng)計(jì)外泌體的顆粒大小及分布	檢測外泌體內(nèi)容物 使用ExoView Cargo試劑盒可探測外泌體內(nèi)部核酸的裝載情況，分析裝載率
熒光檢測 具備3個(gè)熒光通道，能夠探測單個(gè)蛋白的結(jié)合	線性工作流程 最高9個(gè)樣品的全自動分析
無須純化 無需擔(dān)心純化帶來的誤差，更精確的測量樣品間的表征和表達(dá)信息的差異	多重樣本分析 最多可使用6種表面標(biāo)記物來篩選外泌體

外泌體粒徑分析

能夠?qū)?gt;50 nm的外泌體進(jìn)行全方面的表征，無論是粒徑尺寸、粒徑分布還是外泌體的亞型均可在一次測試中得到。并且所用來測試的樣本無需進(jìn)行純化，避免因純化帶來的樣本偏差。

分析不同大小和不同尺度的外泌體亞群，在CD171過表達(dá)系統(tǒng)中，100 nm以上的外泌體僅表達(dá)了CD171。

量化外泌體亞群

通過抗體捕獲的模式，能夠量化含有不同標(biāo)記物的外泌體亞群，并對不同種群的外泌體進(jìn)行特異性計(jì)數(shù)和分析。整個(gè)過程無需純化，并且線性范圍可跨越3個(gè)數(shù)量級。

TSPAN8陽性細(xì)胞外囊泡的稀釋曲線。使用1:3比例的梯度稀釋。用R2 = 0.9986計(jì)算與TSPAN8熒光數(shù)據(jù)的線性擬合。

檢測外囊泡中的裝載物

MISEV建議在表征外泌體和外囊泡時(shí)，應(yīng)當(dāng)同時(shí)測量表面和載體蛋白。使用ExoView芯片可穿透外泌體，探測膜內(nèi)蛋白和載體。并且單次可定量3種表面、管腔蛋白。

檢測細(xì)胞外泌體內(nèi)的Syntenin。

WT細(xì)胞在未穿膜的條件下幾乎觀測不到Syntenin的信號。進(jìn)行穿膜處理后可以觀測到Syntenin信號，而KO之后信號消失

生物標(biāo)志物共定位

能夠在單個(gè)外泌體樣本上檢測多達(dá)4種標(biāo)記物，并同時(shí)提供外泌體的其它表征數(shù)據(jù)諸如計(jì)數(shù)、顆粒尺寸統(tǒng)計(jì)等。

無需純化

只測量含有靶標(biāo)抗原的特定細(xì)胞外泌體群體。僅需35 μL的稀釋樣品，即可直接獲得外泌體的表型、粒徑和計(jì)數(shù)信息。并且無需擔(dān)心污染物對測試的影響。

無論純化與否，Exoview均可進(jìn)行分析

ExoView™ Kit 配置清單:

應(yīng)用案例：

對不同體液中小RNA測序以篩選最佳的胞外RNA提取方法

exRNA profile會受到不同來源（細(xì)胞/組織），不同狀態(tài)（年齡/健康程度/器官狀態(tài)）的影響，且由包括外泌體在內(nèi)的不同的載體運(yùn)輸，加上不同的提取方法和檢測技術(shù)，均會影響exRNA profile的測定結(jié)果。現(xiàn)今的小RNA測序方法已經(jīng)可以準(zhǔn)確地表征exRNA profile，因此合適的exRNA提取方法便至關(guān)重要。Srinivasan[1]等通過使用多種exRNA分離方法分離不同位點(diǎn)獲得的5種體液中的外泌體，分析結(jié)果后總結(jié)出了不同體液的適合分離方法。

其中，研究人員使用單個(gè)外泌體表型分析技術(shù)(Exoview)檢測了來源于人血漿的外泌體的蛋白marker表達(dá)，判斷出血漿外泌體根據(jù)蛋白marker主要分為CD63-/CD81+/CD9+和CD63+/CD81+/CD9+兩種。

人血漿外泌體蛋白表達(dá)分析

參考文獻(xiàn)：[1] Srinivasan, S., Yeri, A., Cheah, P. S., Chung, A., Danielson, K., De Hoff, P., ... & Laurent, L. C. (2019). Small RNA sequencing across diverse biofluids identifies optimal methods for exRNA isolation. Cell, 177(2), 446-462.

Brain Behavior and Immunity：脊髓損傷導(dǎo)致血清神經(jīng)炎癥相關(guān)納米顆粒中miRNA與CD81+外泌體水平的改變

脊髓損傷（SCI）會對機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性影響，導(dǎo)致呼吸、免疫、消化等功能異常，以及相關(guān)腦區(qū)產(chǎn)生神經(jīng)炎癥和退行性病變。有研究表明，SCI的病理與系統(tǒng)性影響可能與血液來源的因子如外泌體的運(yùn)輸有關(guān)；而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，外泌體可能參與了miRNA等炎性因子運(yùn)輸導(dǎo)致炎癥擴(kuò)散。Khan等[1]使用包括Exoview外泌體表型分析的多種技術(shù)詳細(xì)表征了SCI建模的小鼠血漿外泌體，發(fā)現(xiàn)損傷后外泌體數(shù)量、蛋白marker和內(nèi)容物均有明顯的變化，將SCI小鼠的外泌體注射入腦室還可誘發(fā)產(chǎn)生炎癥。

研究人員使用ExoView檢測了SCI血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強(qiáng)度和共定位（圖1A）。外泌體在CD81和CD9區(qū)域產(chǎn)生特異性結(jié)合而被捕獲，而沒有CD63捕獲。根據(jù)干涉成像獲得外泌體尺寸分布，其中在50nm最多（圖1B&C）。熒光成像則檢測到了大量干涉成像檢測不出的尺寸小于50nm的外泌體（圖1D&E），CD81和CD9在大量外泌體上表型出熒光共定位，而CD63熒光則未被檢測到，這與圖1C結(jié)果一致（圖1F-H）。相比之下，NTA與流式分析無法檢測到尺寸小于50nm的外泌體。

圖1 ExoView檢測血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強(qiáng)度和共定位

研究人員進(jìn)一步比較了SCI組和對照組的血漿外泌體變化，結(jié)果表明，在損傷后1d的時(shí)間點(diǎn)，CD81外泌體數(shù)量相對對照組更高，與Western Blot的結(jié)果一致；而CD9外泌體數(shù)量則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與流式分析的結(jié)果一致（圖2A&B）?；趫D2H的CD81與CD9有大量的熒光共定位，檢測CD9外泌體的CD81熒光強(qiáng)度，由1d的熒光強(qiáng)度中位數(shù)差異可知，

圖2 ExoView檢測血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強(qiáng)度和共定位

參考文獻(xiàn)：[1] Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2020). Spinal cord injury alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and immunity.

Cells：CD44糖蛋白在胃癌發(fā)生中的作用

CD44是一種跨膜糖蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間與細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用，主要配體為透明質(zhì)酸（HA）。研究表明，CD44與腫瘤的生長相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且CD44與HA的結(jié)合親和力高，因此納米載體常用HA做表面修飾以作為腫瘤細(xì)胞的靶向藥物載體。外泌體是天然的靶向信息傳遞載體，有研究在外泌體中檢測到CD44。H?rk?nen等[1]使用胃癌細(xì)胞MKN74研究了CD44表達(dá)對外泌體分泌，HA合成與腫瘤細(xì)胞生長的影響。結(jié)果表明，CD44促進(jìn)了細(xì)胞表面和細(xì)胞間的HA形成，調(diào)控腫瘤微環(huán)境；CD44可改變外泌體的物理性質(zhì)以及靶向性質(zhì)。

其中，研究人員使用Exoview檢測了MKN74細(xì)胞的未經(jīng)純化的培養(yǎng)基及分離純化后的外泌體中的含CD44以及其他標(biāo)記物的含量。結(jié)果表明，相對于對照組，MOCK（CD44敲除）細(xì)胞組在未經(jīng)純化的培養(yǎng)基及分離純化后的分泌外泌體的數(shù)量顯著降低。以上結(jié)果表示ExoView可以直接對復(fù)雜環(huán)境的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測，無需分離純化步驟，且檢測結(jié)果具有*特異性。

ExoView檢測表達(dá)不同蛋白標(biāo)記物的外泌體數(shù)量

參考文獻(xiàn)：[1] H?rk?nen, K., Oikari, S., Kyykallio, H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

Cancer Cell Int：外泌體與miRNA調(diào)節(jié)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的干細(xì)胞性

腦瘤中部分細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，能夠自我更新并分化為不同細(xì)胞系。其中，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的病人有25%經(jīng)過傳統(tǒng)療法后5年內(nèi)復(fù)發(fā)并轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡，存活的病人也受到治療副作用和并發(fā)癥影響，因此需要一種安全有效的治療方法。腫瘤細(xì)胞的外泌體含有miRNA，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等生理過程并與抗藥性相關(guān)。有研究表明腫瘤干細(xì)胞的外泌體運(yùn)載了腫瘤細(xì)胞*的miRNA，能夠產(chǎn)生有利于腫瘤發(fā)展的微環(huán)境。Choi等[1]研究了成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的外泌體及運(yùn)載的miRNA及其在腫瘤康復(fù)中的潛在作用。其中，miR-135b和miR-135a在腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，抑制兩者會導(dǎo)致具有腫瘤抑制作用的Angiomotin?like 2（AMOTL2）表達(dá)上升，使腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞特性下降。

其中，研究人員使用ExoView通過熒光成像檢測腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的外泌體標(biāo)記物，在兩種細(xì)胞的外泌體上均檢測到了Alix和Syntenin兩種內(nèi)蛋白，并且可以確定兩種內(nèi)蛋白與CD63/CD9外泌體標(biāo)記物共定位。

Exoview檢測外泌體上的Alix（a）與Syntenin（b）蛋白

參考文獻(xiàn)：[1] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J. H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

ExoView外泌體全面表征試劑盒